Il Salone dalla Fontana o Sala di Tivoli rappresenta il cuore del palazzo, luogo di rappresentanza per eccellenza e di incontro privilegiato fra l'interno e il giardino. La sala prende il nome dalla fontana rustica, sullo stile di quelle presenti nella Manica Lunga  rivestita in mosaico e smalti, opera iniziata dal fontaniere Curzio Maccarone e completata nel 1568 da Paolo Calandrino; nella nicchia centrale è rappresentata la città di Tivoli con il tempio della Sibilla e le acque. Le pitture delle pareti e del soffitto dilatano illusionisticamente lo spazio, mostrando le proprietà del Cardinale - come l'affresco che mostra Villa d'Este e il giardino ancora in costruzione - e il paesaggio che le circonda. Sul soffitto decorato a grottesche si apre un colonnato in prospettiva e al centro il Convito degli dei, affresco ispirato a quello di Raffello nella Farnesina. Le vedute sono state realizzate nel 1568 da Matteo Neroni da Siena. Il Salone amplifica il concetto di continuo gioco illustionistico tra l'interno e l'esterno.